牛胚胎移植技术规程
来源:通辽市家畜繁育指导站 | 作者:通辽市家畜繁育指导站 | 发布时间: 2014-12-19 | 5005 次浏览 | 分享到:

1 范围

本标准规定了牛胚胎移植的主要技术。包括供体牛选择、超排处理、人工授精、胚胎收集、受体牛准备、移植、妊娠诊断等。

本标准适用于通辽地区养牛场(户)。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

NY/T 815 肉牛饲养标准

DB1505/T 065 科尔沁肉牛兽医防疫准则

DB1505/T 067 牛冷冻精液人工授精技术规范

DB1505/T 074 牛妊娠诊断规程

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1 供体

提供胚胎的母牛。

3.2 受体

接受胚胎并代之完成妊娠、分娩、哺乳犊牛的母牛。

3.3 同期发情

同期发情又称同步发情,就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程,使之在预定时间内集中发情。

3.4 超数排卵

在母牛发情周期的适当时期,注射促性腺激素,使卵巢上比自然生理状态下有更多的卵泡发育并排卵的方法简称超排

3.5 冲胚

    利用冲卵液将胚胎冲出,并收集在器皿中。

3.6 检胚

    指对冲出的胚胎的完整性、活力进行形态学检测并鉴定等级。

4 供体牛的选择标准

4.1 谱系清楚,生产性能优良,种用价值高。

4.2 繁殖性能良好,有连续2个或2个以上正常发情周期。

4.3 营养状况好,膘情中上等。

4.4 无生殖系统疾病和传染性疾病。

4.5 与配种公牛必须是经过后裔测定的优秀个体,育种值排名靠前。

5 受体牛的准备

5.1 受体牛选择

可选择生长发育正常、健康无病、乳房发育良好、繁殖力较强、体格适中的母牛,最好是经产母牛。

5.2 组群

5.2.1 外购受体牛应来自非疫区,并经兽医部门检疫合格的健康空怀母牛。

5.2.2 外购母牛隔离、免疫、驱虫执行DB1505/T 065

5.2.3 受体牛佩戴耳标。

5.3 受体牛的饲养管理

5.3.1 受体牛的饲养标准参照NY/T 815

5.3.2 详细观察受体牛的日常行为、发情状况、健康状态。

5.4 受体牛的同期发情

5.4.1 受体牛的发情时间与供体牛超排后的发情时间应确保一致,前后不超过1d

5.4.2 同期发情方法

前列腺素(PGF)法:一次注射法是在发情周期的第9d注射PGF,通常在2d3d内发情。在不清楚发情周期的情况下采用两次注射法,即第一次注射后间隔10d12d再进行第二次注射。约90%于注射后24h48h发情。

孕激素法:每日肌注或口服孕酮类似物如氯前列烯醇(PGC2ml0.2mg。处理12d18d,停药2d3d后出现发情。

5.4.3 受体牛发情鉴定方法与供体牛相同。

6 供体牛的超排处理

6.1 通常采用促卵泡素(FSH+前列腺素(PG)法。

6.2 程序

供体牛发情后的第9d13d 肌注FSH,以日递减法连续注射4d,每天早晚等量注射2次(每隔12h),使用总剂量按照牛的体重、胎次作适当调整。详见表1

1 发情9d13d超排处理及药物剂量表

 

 

起始注射量(mg

连续注射4d每日递减(mg

经产牛

育成牛

FSH

国产

810

68

0.20.4

进口

300400

200300

20

1(续)

PG

氯前列烯醇

肌注

注射FSH 56针后

0.40.6

子宫灌注

注射FSH 56针后

0.20.3

超排药品的剂量和比例应根据不同厂家和批号作调整。

7 供体牛的人工授精

7.1 发情鉴定

供体牛超排处理后,一般12h48h出现发情征兆。发情鉴定执行DB1505/T 067

7.2 配种

执行DB1505/T 067

8 胚胎收集

8.1 方法

    采用非手术法。

8.2 准备

8.2.1 回收胚胎在配种后6d8d进行。冲胚前一天开始停饲并限制饮水,以减轻冲胚操作时腹压和瘤胃压力的影响。

8.2.2 准备好冲胚器械和冲卵液。冲卵液使用杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBSS,其成分和配方见附录A

8.3 供体牛的保定与消毒。

    保定供体牛,用2%盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉,用18号针头,每头牛约5ml。应将外阴部及阴唇清洗消毒,再用消毒过的纸巾擦干。

8.4 胚胎回收

8.4.1 固定冲卵器

    供体牛尾部麻醉后,操作者一只手伸入直肠握住子宫颈,另一只手持内管穿插有金属探针的双通式或三通式导管冲卵器,使其依次通过阴门、阴道、子宫颈和子宫体,最后头部抵达一侧子宫角的基部。然后通过充气孔充气15ml20ml,使其头部的气囊膨胀以固定在子宫角内腔的基部,以免冲卵液流入子宫体并沿子宫颈流出。

8.4.2 注入冲卵液

D-PBSS 冲卵液吊瓶挂在距母牛外阴上方0.8m1m高处,接三通管和冲卵管,用进流开关和出流开关控制流量,每次灌注30ml50ml D-PBSS冲卵液,单侧总量为300ml500ml。也可用50ml一次性注射器分次注射和抽吸(剂量为30ml50ml),具有相同的冲排效果。另侧子官冲胚时应先重新插入钢芯和放气,将其移入另侧子官角后用同样方法冲胚。冲胚结束后放气,将采卵管移入子宫体后,在子宫体推注抗生素(如土霉素100IU 或宫乳康10ml20ml),肌注氯前列烯醇(PGC0.4mg,间隔12h 后再用0.4mg

9 胚胎检查

9.1 检胚

采用漏斗法接收回收液,静置10min,等胚胎下沉后移去上层液,可将最后留在斗中的回收液倒入玻璃皿中直接捡胚,捡到胚胎应及时移入含有10%20%犊牛血清的D-PBSS培养液中;进行净化处理,对回收的胚胎进行形态学鉴定确定等级。

从回收液中捡胚可用实体显微镜放大16倍~20倍。将找到的胚胎用吸管捡出放入装有D-PBSS保存液的器皿中,按顺序依次轻轻吸胚、清洗,可先吸些D-PBSS吹向胚的周围,使胚在液滴中翻腾,清除卵周围的黏连物,一般需清洗3次。

9.2 胚胎质量鉴定

9.2.1 将净化后的胚胎置于D-PBSS液中,放大40倍~200倍作形态学检查。胚龄通常以母畜发情日为0天来计算,距发情日的天数即为胚龄。

9.2.2 胚胎发育特征

适于移植的胚胎胚龄为6d8d,相对应的胚胎发育阶段为桑椹胚至囊胚,其发育表现为:

9.2.2.1 桑椹胚 

受精后第5d6d 回收的胚胎,能观察到球状细胞团,分不清分裂球,占据透明带内腔的大部分。

9.2.2.2 致密桑椹胚 

受精后第6d7d 回收的胚胎,细胞团变小,占透明带内腔的60%70%

9.2.2.3  早期囊胚 

受精后第7d8d 回收的胚胎,细胞的一部分出现发亮的胚泡腔,细胞团占透明带内腔的70%80%,难以分清内细胞团和滋养层。

9.2.2.4 囊胚 

受精后第7d8d 回收的胚胎,内细胞团和滋养层界限清晰,胚泡腔明显,细胞充满透明带内腔。

9.2.2.5 扩张囊胚 

受精后第8d9d 回收的胚胎,胚泡腔明显扩大,体积增至原来的1.2倍~1.5倍,与透明带之间无空隙,透明带变薄,相当于正常厚度的1/3

9.2.2.6 孵育胚 

透明带破裂,细胞团孵出透明带。

9.2.3 胚胎的分级

9.2.3.1 1级 优良胚胎:形态典型,卵细胞和分裂球的轮廓清晰,细胞质致密,色调和分布极均一。

9.2.3.2 2级 普通胚胎:与典型的胚胎相比,稍有变形,但卵细胞和分裂球的轮廓清晰,细胞质较致密,分布均匀,变性细胞和水泡不超过10%30%

9.2.3.3  3 不良胚胎:形态有明显变异,卵细胞和分裂球轮廓稍不清晰,或部分不清晰,细胞质不致密,分布不均匀,色调发暗,突出的细胞、水泡和变性细胞占30%50%

9.2.3.4 4 凡总体形态结构不正常的卵子,未受精的、退化的或破碎的卵子,透明带空的或将要空的卵子,以及与正常胚龄相比,发育迟2d2d以上的胚胎均难以继续正常发育,不宜移植。

10 胚胎的装管、冷冻和解冻

10.1 装管

10.1.1 采用一步平衡法,

冷冻保存液为含10%甘油的D-PBSS液。将胚胎在基础液(PBS10%BSA 冲卵液)中洗涤5次~10次,在10%甘油第1液中平衡5min,在10%甘油第2液中平衡10min后装管。

注:10BSA 冲卵液:含10%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗

10.1.2 胚胎装管方法:

将平衡好的胚胎用0.25ml 细管装管备用。3 段法装管的顺序是:3cm 12.5%蔗糖PBS液、0.5cm气泡、1.0cm10%甘油PBS液(含胚胎)、0.5cm气泡、2cm12.5%蔗糖PBS液。用封口塞、聚乙醇粉末封口或热封法将开口端封口,按程序进行冷冻。

10.2 冷冻

将装入胚胎的细管放入0℃冷冻仪平衡10min,以1℃/min速度降温,(-7-6诱发结晶,平衡10min。随后将冷冻仪以0.5℃/min (O.3O.8℃/min)降至-30℃,然后将冷冻后的胚胎分装标记放入液氮罐中长期保存。

10.3 解冻

从液氮罐中取出胚胎细管,在空中停留1s,放入3638℃水浴中停留10s解冻后,用生理盐水清洗,剪去棉塞端,与带有空气的1ml注射器连接上。再剪去细管的另一端封口,将胚胎推到干燥洁净器皿内。采用分步法脱除甘油,分别间隔5min,依次通过1摩尔、0.75摩尔、0.50摩尔、0.25摩尔的甘油磷酸盐缓冲液,最后通过含10%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗2次~3次,去除甘油,移至不含甘油的PBS保存液中镜检待用。

10.4 胚胎细管标记

胚胎细管应标记和登记。存档资料包括胚胎系谱、代码、保存方法、应用单位。胚胎标记包括序列号、父本、母本、胚胎发育期和级别及数量、胚胎生产单位和胚胎生产日期。

11 胚胎移植

分为鲜胚移植和冻胚移植。

11.1 受体牛黄体检查

    要求受体牛发情时直肠检查的卵泡直径在10mm20mm左右,发情后36h出现排卵。黄体发育达到一级和二级发育水平的才能进行胚胎移植。黄体发育程度判定条件如下:

11.1.1 一级黄体

黄体形态和发情天数一致,黄体呈乳头状突出于卵巢表面。黄体直径2.0cm左右,约拇指大小,呈软肉状,排卵点火山口状突起明显。

11.1.2 二级黄体

黄体形态和发情天数基本一致。黄体直径1.5cm 左右,约中指肚大小,呈硬肉状,排卵点突起较明显。

11.1.3 三级黄体

黄体直径1.0cm 左右,手摸约小拇指大小,硬而突起不明显。黄体发育不良的母牛应及时淘汰。

11.2 受体牛的准备

保定受体牛,清除便污,肌注2%静松灵1ml或用2%的普鲁卡因3mll2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴,用高锰酸钾水冲洗消毒,用灭菌纸擦干,最后经酒精棉球消毒。

11.3 器械准备

先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好,高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,装入移植枪内,套上保护外套。

11.4 移植前胚胎装管

0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液,中间由两个气泡隔开,中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段装管,胚胎在中段。一步吸管法解冻脱甘油后,用酒精棉球多次消毒吸管,剪去封口即可用于移植。

11.5 移植

操作员一只手伸进直肠,另一只手持移植器插入阴道,移植器到达子宫颈口时,用力将移植枪捅破外套填片,插入子宫颈。在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体一侧子宫角至大弯处,持移植器的手推出胚胎,缓慢旋转地抽出移植枪。

12 妊娠诊断

采用外部观察法和直肠检查法,执行DB1505/T 074