1 范围
本标准规定了牛胚胎移植的主要技术。包括供体牛选择、超排处理、人工授精、胚胎收集、受体牛准备、移植、妊娠诊断等。
本标准适用于通辽地区养牛场（户）。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
NY/T 815 肉牛饲养标准
DB1505/T 065 科尔沁肉牛兽医防疫准则
DB1505/T 067 牛冷冻精液人工授精技术规范
DB1505/T 074 牛妊娠诊断规程
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1 供体
提供胚胎的母牛。
3.2 受体
接受胚胎并代之完成妊娠、分娩、哺乳犊牛的母牛。
3.3 同期发情
同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。
3.4 超数排卵
在母牛发情周期的适当时期，注射促性腺激素，使卵巢上比自然生理状态下有更多的卵泡发育并排卵的方法简称“超排”。
3.5 冲胚
利用冲卵液将胚胎冲出，并收集在器皿中。
3.6 检胚
指对冲出的胚胎的完整性、活力进行形态学检测并鉴定等级。
4 供体牛的选择标准
4.1 谱系清楚，生产性能优良，种用价值高。
4.2 繁殖性能良好，有连续2个或2个以上正常发情周期。
4.3 营养状况好，膘情中上等。
4.4 无生殖系统疾病和传染性疾病。
4.5 与配种公牛必须是经过后裔测定的优秀个体，育种值排名靠前。
5 受体牛的准备
5.1 受体牛选择
可选择生长发育正常、健康无病、乳房发育良好、繁殖力较强、体格适中的母牛，最好是经产母牛。
5.2 组群
5.2.1 外购受体牛应来自非疫区，并经兽医部门检疫合格的健康空怀母牛。
5.2.2 外购母牛隔离、免疫、驱虫执行DB1505/T 065。
5.2.3 受体牛佩戴耳标。
5.3 受体牛的饲养管理
5.3.1 受体牛的饲养标准参照NY/T 815。
5.3.2 详细观察受体牛的日常行为、发情状况、健康状态。
5.4 受体牛的同期发情
5.4.1 受体牛的发情时间与供体牛超排后的发情时间应确保一致，前后不超过1d。
5.4.2 同期发情方法
前列腺素（PGF2α）法：一次注射法是在发情周期的第9d注射PGF2α，通常在2d～3d内发情。在不清楚发情周期的情况下采用两次注射法，即第一次注射后间隔10d～12d再进行第二次注射。约90%于注射后24h～48h发情。
孕激素法：每日肌注或口服孕酮类似物如氯前列烯醇（PGC）2ml或0.2mg。处理12d～18d，停药2d～3d后出现发情。
5.4.3 受体牛发情鉴定方法与供体牛相同。
6 供体牛的超排处理
6.1 通常采用促卵泡素（FSH）+前列腺素（PG）法。
6.2 程序
供体牛发情后的第9d～13d 肌注FSH，以日递减法连续注射4d，每天早晚等量注射2次（每隔12h），使用总剂量按照牛的体重、胎次作适当调整。详见表1。
表1 发情9d～13d超排处理及药物剂量表
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激 素 |
产 地 |
起始注射量（mg） |
连续注射4d每日递减（mg） |
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|
经产牛 |
育成牛 |
|||
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FSH |
国产 |
8～10 |
6～8 |
0.2～0.4 |
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进口 |
300～400 |
200～300 |
20 |
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表1（续）
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PG 氯前列烯醇 |
肌注 |
注射FSH 5～6针后 |
0.4～0.6 |
|
子宫灌注 |
注射FSH 5～6针后 |
0.2～0.3 |
超排药品的剂量和比例应根据不同厂家和批号作调整。
7 供体牛的人工授精
7.1 发情鉴定
供体牛超排处理后，一般12h～48h出现发情征兆。发情鉴定执行DB1505/T 067。
7.2 配种
执行DB1505/T 067。
8 胚胎收集
8.1 方法
采用非手术法。
8.2 准备
8.2.1 回收胚胎在配种后6d～8d进行。冲胚前一天开始停饲并限制饮水，以减轻冲胚操作时腹压和瘤胃压力的影响。
8.2.2 准备好冲胚器械和冲卵液。冲卵液使用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBSS）,其成分和配方见附录A。
8.3 供体牛的保定与消毒。
保定供体牛，用2%盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用18号针头，每头牛约5ml。应将外阴部及阴唇清洗消毒，再用消毒过的纸巾擦干。
8.4 胚胎回收
8.4.1 固定冲卵器
供体牛尾部麻醉后，操作者一只手伸入直肠握住子宫颈，另一只手持内管穿插有金属探针的双通式或三通式导管冲卵器，使其依次通过阴门、阴道、子宫颈和子宫体，最后头部抵达一侧子宫角的基部。然后通过充气孔充气15ml～20ml，使其头部的气囊膨胀以固定在子宫角内腔的基部，以免冲卵液流入子宫体并沿子宫颈流出。
8.4.2 注入冲卵液
将D-PBSS 冲卵液吊瓶挂在距母牛外阴上方0.8m～1m高处，接三通管和冲卵管，用进流开关和出流开关控制流量，每次灌注30ml～50ml D-PBSS冲卵液，单侧总量为300ml～500ml。也可用50ml一次性注射器分次注射和抽吸（剂量为30ml～50ml），具有相同的冲排效果。另侧子官冲胚时应先重新插入钢芯和放气，将其移入另侧子官角后用同样方法冲胚。冲胚结束后放气，将采卵管移入子宫体后，在子宫体推注抗生素（如土霉素100万IU 或宫乳康10ml～20ml），肌注氯前列烯醇（PGC）0.4mg，间隔12h 后再用0.4mg。
9 胚胎检查
9.1 检胚
采用漏斗法接收回收液，静置10min，等胚胎下沉后移去上层液，可将最后留在斗中的回收液倒入玻璃皿中直接捡胚，捡到胚胎应及时移入含有10%～20%犊牛血清的D-PBSS培养液中；进行净化处理，对回收的胚胎进行形态学鉴定确定等级。
从回收液中捡胚可用实体显微镜放大16倍～20倍。将找到的胚胎用吸管捡出放入装有D-PBSS保存液的器皿中，按顺序依次轻轻吸胚、清洗，可先吸些D-PBSS吹向胚的周围，使胚在液滴中翻腾，清除卵周围的黏连物，一般需清洗3次。
9.2 胚胎质量鉴定
9.2.1 将净化后的胚胎置于D-PBSS液中，放大40倍～200倍作形态学检查。胚龄通常以母畜发情日为0天来计算，距发情日的天数即为胚龄。
9.2.2 胚胎发育特征
适于移植的胚胎胚龄为6d～8d,相对应的胚胎发育阶段为桑椹胚至囊胚，其发育表现为：
9.2.2.1 桑椹胚
受精后第5d～6d 回收的胚胎，能观察到球状细胞团，分不清分裂球，占据透明带内腔的大部分。
9.2.2.2 致密桑椹胚
受精后第6d～7d 回收的胚胎，细胞团变小，占透明带内腔的60%～70%。
9.2.2.3 早期囊胚
受精后第7d～8d 回收的胚胎，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔，细胞团占透明带内腔的70%～80%，难以分清内细胞团和滋养层。
9.2.2.4 囊胚
受精后第7d～8d 回收的胚胎，内细胞团和滋养层界限清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。
9.2.2.5 扩张囊胚
受精后第8d～9d 回收的胚胎，胚泡腔明显扩大，体积增至原来的1.2倍～1.5倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/3。
9.2.2.6 孵育胚
透明带破裂，细胞团孵出透明带。
9.2.3 胚胎的分级
9.2.3.1 1级 优良胚胎：形态典型，卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质致密，色调和分布极均一。
9.2.3.2 2级 普通胚胎：与典型的胚胎相比，稍有变形，但卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质较致密，分布均匀，变性细胞和水泡不超过10%～30%。
9.2.3.3 3级 不良胚胎：形态有明显变异，卵细胞和分裂球轮廓稍不清晰，或部分不清晰，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，突出的细胞、水泡和变性细胞占30%～50%。
9.2.3.4 4级 凡总体形态结构不正常的卵子，未受精的、退化的或破碎的卵子，透明带空的或将要空的卵子，以及与正常胚龄相比，发育迟2d或2d以上的胚胎均难以继续正常发育，不宜移植。
10 胚胎的装管、冷冻和解冻
10.1 装管
10.1.1 采用一步平衡法，
冷冻保存液为含10%甘油的D-PBSS液。将胚胎在基础液（PBS＋10%BSA 冲卵液）中洗涤5次～10次，在10%甘油第1液中平衡5min，在10%甘油第2液中平衡10min后装管。
注：10％BSA 冲卵液：含10%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗
10.1.2 胚胎装管方法：
将平衡好的胚胎用0.25ml 细管装管备用。3 段法装管的顺序是：3cm 12.5%蔗糖PBS液、0.5cm气泡、1.0cm10%甘油PBS液（含胚胎）、0.5cm气泡、2cm12.5%蔗糖PBS液。用封口塞、聚乙醇粉末封口或热封法将开口端封口，按程序进行冷冻。
10.2 冷冻
将装入胚胎的细管放入0℃冷冻仪平衡10min，以1℃/min速度降温，（-7～-6）℃诱发结晶，平衡10min。随后将冷冻仪以0.5℃/min (O.3～O.8℃/min)降至-30℃，然后将冷冻后的胚胎分装标记放入液氮罐中长期保存。
10.3 解冻
从液氮罐中取出胚胎细管，在空中停留1s，放入36～38℃水浴中停留10s解冻后，用生理盐水清洗，剪去棉塞端，与带有空气的1ml注射器连接上。再剪去细管的另一端封口，将胚胎推到干燥洁净器皿内。采用分步法脱除甘油，分别间隔5min，依次通过1摩尔、0.75摩尔、0.50摩尔、0.25摩尔的甘油磷酸盐缓冲液，最后通过含10%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗2次～3次，去除甘油，移至不含甘油的PBS保存液中镜检待用。
10.4 胚胎细管标记
胚胎细管应标记和登记。存档资料包括胚胎系谱、代码、保存方法、应用单位。胚胎标记包括序列号、父本、母本、胚胎发育期和级别及数量、胚胎生产单位和胚胎生产日期。
11 胚胎移植
分为鲜胚移植和冻胚移植。
11.1 受体牛黄体检查
要求受体牛发情时直肠检查的卵泡直径在10mm～20mm左右，发情后36h出现排卵。黄体发育达到一级和二级发育水平的才能进行胚胎移植。黄体发育程度判定条件如下：
11.1.1 一级黄体
黄体形态和发情天数一致，黄体呈乳头状突出于卵巢表面。黄体直径2.0cm左右，约拇指大小，呈软肉状，排卵点火山口状突起明显。
11.1.2 二级黄体
黄体形态和发情天数基本一致。黄体直径1.5cm 左右，约中指肚大小，呈硬肉状，排卵点突起较明显。
11.1.3 三级黄体
黄体直径1.0cm 左右，手摸约小拇指大小，硬而突起不明显。黄体发育不良的母牛应及时淘汰。
11.2 受体牛的准备
保定受体牛，清除便污，肌注2%静松灵1ml或用2%的普鲁卡因3ml在l～2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。
11.3 器械准备
先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套。
11.4 移植前胚胎装管
用0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段装管，胚胎在中段。一步吸管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒吸管，剪去封口即可用于移植。
11.5 移植
操作员一只手伸进直肠，另一只手持移植器插入阴道，移植器到达子宫颈口时，用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体一侧子宫角至大弯处，持移植器的手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。
12 妊娠诊断
采用外部观察法和直肠检查法，执行DB1505/T 074。